Xây dựng quy trình phát hiện đột biến điểm trên gen MECP2 ở bệnh nhi Việt Nam mắc hội chứng Rett
Tổng quan: Hội chứng Rett là một bệnh lý rối loạn chức năng não bộ tuy hiếm gặp nhưng ảnh
hưởng rất nghiêm trọng lên sự phát triển bình thường của trẻ; bệnh chủ yếu gặp ở nữ với tỷ lệ
1 trên 10,000 - 15,000 trẻ em gái. Nguyên nhân gây bệnh chủ yếu do các biến thể de novo trên
gen MECP2. Trên 80% bệnh nhân mắc hội chứng Rett mang đột biến điểm trên gen này. Nghiên
cứu mối tương quan kiểu gen-kiểu hình trong hội chứng Rett mang lại cơ hội điều trị cho bệnh
nhi. Ở Việt Nam, việc chẩn đoán chủ yếu dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng, chưa chú trọng đến xét
nghiệm gen. Vì vậy, xây dựng một quy trình xét nghiệm rà soát đột biến điểm gen MECP2 cung
cấp bằng chứng cho chẩn đoán lâm sàng là cần thiết, đặc biệt hỗ trợ chẩn đoán trong giai đoạn
sớm của bệnh nhi.
Đối tượng và phương pháp: Chuẩn hoá quy trình xét nghiệm gen MECP2 trên mẫu đối chứng
bao gồm tối ưu hoá phản ứng PCR và giải trình tự Sanger. Đọc biến thể bằng phần mềm CLC
workbench. Phân tích các biến thể được tìm thấy; đánh giá khả năng gây bệnh của biến thể bằng
tiêu chuẩn ACMG. Quy trình hoàn thiện được ứng dụng lên 4 mâũ bệnh nhi mắc hội chứng Rett
điều trị tại bệnh viện Nhi đồng II từ 01/2019 đến 12/2019.
Kết quả: Chúng tôi đã thiết kế mồi và khuếch đại thành công cả 4 exon cùng các vùng lân cận
đầu exon-intron của gen MECP2, đặc biệt exon 1 là vùng gen giàu GC (trên 65%). Kết quả giải trình
tự cho tín hiệu tốt. Tìm thấy hai biến thể gây bệnh (p.R294X, p.K29X), trong đó có 1 biến thể mới
chưa từng được công bố.
Kết luận: Quy trình giải trình gen MECP2 bằng kỹ thuật PCR-giải trình tự Sanger được tối ưu hoá
thành công; đồng thời bổ sung 1 đột biến mới vào cơ sở dữ liệu biến thể gen MECP2.
Trang 1
Trang 2
Trang 3
Trang 4
Trang 5
Trang 6
Trang 7
Trang 8
Tóm tắt nội dung tài liệu: Xây dựng quy trình phát hiện đột biến điểm trên gen MECP2 ở bệnh nhi Việt Nam mắc hội chứng Rett
Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Sức khỏe, 1(1):27-34 Open Access Full Text Article Bài nghiên cứu 1Bệnh viện Nhi Đồng 2 TP HCM, Việt Nam 2Trường Đại học Tôn Đức Thắng, Việt Nam 3Khoa Y, ĐHQG-HCM, Việt Nam 4Trường Đại học Nông Lâm, Việt Nam Liên hệ Huỳnh Thị Diệu Hiền, Khoa Y, ĐHQG-HCM, Việt Nam Email: htdhien@medvnu.edu.vn Lịch sử Ngày nhận: 23-06-2020 Ngày chấp nhận: 22-9-2020 Ngày đăng: 10-11-2020 DOI : Bản quyền © ĐHQG Tp.HCM. Đây là bài báo công bố mở được phát hành theo các điều khoản của the Creative Commons Attribution 4.0 International license. Xây dựng quy trình phát hiện đột biến điểm trên genMECP2 ở bệnh nhi Việt Nammắc hội chứng Rett Lê Thị Khánh Vân1, Lê Duy Thái Dương2, Đỗ Thị Thu Hằng3, Huỳnh Thị Thuý Kiều1, Nguyễn Lê Trung Hiếu1, Bùi Thị Thùy Dung4, Nguyễn Thanh Vũ3, Nguyễn Quốc Dũng3, Huỳnh Thị Diệu Hiền3,* Use your smartphone to scan this QR code and download this article TÓM TẮT Tổng quan: Hội chứng Rett là một bệnh lý rối loạn chức năng não bộ tuy hiếm gặp nhưng ảnh hưởng rất nghiêm trọng lên sự phát triển bình thường của trẻ; bệnh chủ yếu gặp ở nữ với tỷ lệ 1 trên 10,000 - 15,000 trẻ em gái. Nguyên nhân gây bệnh chủ yếu do các biến thể de novo trên gen MECP2. Trên 80% bệnh nhân mắc hội chứng Rett mang đột biến điểm trên gen này. Nghiên cứu mối tương quan kiểu gen-kiểu hình trong hội chứng Rett mang lại cơ hội điều trị cho bệnh nhi. Ở Việt Nam, việc chẩn đoán chủ yếu dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng, chưa chú trọng đến xét nghiệm gen. Vì vậy, xây dựng một quy trình xét nghiệm rà soát đột biến điểm gen MECP2 cung cấp bằng chứng cho chẩn đoán lâm sàng là cần thiết, đặc biệt hỗ trợ chẩn đoán trong giai đoạn sớm của bệnh nhi. Đối tượng và phương pháp: Chuẩn hoá quy trình xét nghiệm gen MECP2 trên mẫu đối chứng bao gồm tối ưu hoá phản ứng PCR và giải trình tự Sanger. Đọc biến thể bằng phần mềm CLC workbench. Phân tích các biến thể được tìm thấy; đánh giá khả năng gây bệnh của biến thể bằng tiêu chuẩn ACMG. Quy trình hoàn thiện được ứng dụng lên 4 mâũ bệnh nhi mắc hội chứng Rett điều trị tại bệnh viện Nhi đồng II từ 01/2019 đến 12/2019. Kết quả: Chúng tôi đã thiết kế mồi và khuếch đại thành công cả 4 exon cùng các vùng lân cận đầu exon-intron của gen MECP2, đặc biệt exon 1 là vùng gen giàu GC (trên 65%). Kết quả giải trình tự cho tín hiệu tốt. Tìm thấy hai biến thể gây bệnh (p.R294X, p.K29X), trong đó có 1 biến thể mới chưa từng được công bố. Kết luận: Quy trình giải trình gen MECP2 bằng kỹ thuật PCR-giải trình tự Sanger được tối ưu hoá thành công; đồng thời bổ sung 1 đột biến mới vào cơ sở dữ liệu biến thể gen MECP2. Từ khoá: Hội chứng Rett, gen MECP2, giải trình tự Sanger GIỚI THIỆU Hội chứng Rett (RTT, OMIM # 312750) là một bệnh lý ở não gây ra các rối loạn về phát triển thể chất và thần kinhnghiêm trọng đượcmiêu tả lần đầu vàonăm 1966 bởi bác sĩ Rett1. Bệnh nhân được sinh ra trong thai kỳ khỏe mạnh, tiền căn gia đình bình thường, trẻ phát triển bình thường sau sinh. Sau đó, khoảng 6-18 tháng tuổi trở đi trẻ bắt đầu xuất hiện các triệu chứng chậmphát triển, hạn chế giao tiếp bằng cử chỉ và ngôn ngữ, đặc biệt bằng mắt, giảm khả năng trí tuệ và có biểu hiện tự kỷ. Ngôn ngữ của trẻ bị mất một phần hoặc toàn bộ. Trẻ mắc hội chứng Rett giảm khả năng vận động, mất dần khả năng sử dụng bàn tay có chủ đích, có những cử động tự động như xoắn vặn bàn tay và các ngón tay. Ở giai đoạn muộn sau 3 tuổi, các rối loạn vận động, loạn trương lực cơ tiến triển nặng hơn gây bất thường dáng đi và cong vẹo cột sống, giảm sức cơ và tư thế bất thường. Các bệnh nhân thiếu đi một hoặc một số đặc điểm lâm sàng chính của hội chứng Rett điển hình 2,3 được gọi là mắc hội chứng Rett không điển hình 2. Ngoài ra, trẻ còn có các biểu hiện bệnh khác như co giật, khởi phát động kinh sau 3 tuổi, đầu nhỏ, tăng trưởng chậm, bất thường kiểu thở, rối loạn nhịp mạch, khó nuốt, rối loạn giấc ngủ và hành vi,2. Việc chẩn đoán lâm sàng hội chứng Rett thường rơi vào giai đoạn muộn và dễ nhầm với các rối loạn phổ tự kỷ hay chậm phát triển4. Hội chứng Rett chủ yếu ảnh hưởng đến nữ giới. Theo thống kê, tỉ lệ mắc bệnh là 1:10,000 đến 1:15,000 không phân biệt chủng tộc, sắc tộc, vị trí địa lý. Hiếm ca bệnh Rett được ghi nhận ở nam giới, do những tổn hại quá lớn gây ra bởi những bất thường của yếu tố di truyền trước khi trẻ chào đời hoặc chết rất non3,5. Cho đến nay, nguyên nhân di truyền gây raHội chứng Rett có liên quan nhất và được các nhà di truyền học đặc biệt quan tâm nghiên cứu là các biến thể de novo trên gen Methyl-CpG-binding Protein 2 hay gọi tắt là MECP26,7. Biến thể ở gen này là nguyên nhân gây hội chứng Rett với tỉ lệ rất cao khoảng trên 92% trong hội chứng Rett điển hình và 50-70% ở hội chứng Rett Trích dẫn bài báo này: Vân L T K, Dương L D T, Hằng D T T, Kiều H T T, Hiếu N L T, Dung B T T, Vũ N T, Dũng N Q, Hiền H T D. Xây dựng quy trình phát hiện đột biến điểm trên gen MECP2 ở bệnh nhi Việt Nam mắc hội chứn ... c biến thể này được ghi nhận trước đó cho thấy chúng xuất hiện trong hội chứng Rett, tự kỷ, và các hội chứng rối loạn nhận thức không thường xuyên. Biến thể trên genMECP2 đã được báo cáo là nguyên nhân gây ra khoảng hơn 92% các trường hợp mắc hội chứng Rett điển hình và khoảng 50 -70% hội chứng Rett không điển hình 18. Hiện nay, khoảng 1000 biến thể MECP2 đã được phát hiện và phần lớn là đột biến điểm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã ghi nhận hai biến thể p.R294X (cắt cụt gần 45% protein), p.K29R (cắt cụt gần 95% protein) làm mất chức năng 29 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Sức khỏe, 1(1):27-34 Bảng 1: Danh sách 6 cặpmồi khuếch đại genMECP2 TÊN TRÌNH TỰ ĐỘ DÀI ĐOẠN MỒI (bp) ĐỘ DÀI KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN GEN (bp) NGUỒN THAM KHẢO Exon 1 CCATCACAGCCAATGACG 18 385 7 AGGGGGAGGGTAGAGAGGAG 20 Exon 2 TCAAAATGTCCCAAATAGCCCT 22 350 TGTCTTTAGTCTTTGGGGTACTT 23 Exon 3 ACCCACAGCCCAAATTCCTA 20 697 ACGGTCATTTCAAGCACACC 20 Exon 4A GAGTGAGTGGCTTTGGTGAC 20 691 TACGGTCTCCTGCACAGATC 20 Exon 4B ACCACATCCACCCAGGTCAT 20 532 7 TCTCCTCTTTGCAGACGCTG 20 Exon 4C ACCACCATCACCACCACTCAGA 22 518 CCCTGAAGCCACGAAACTCTAA 22 19 Hình 2: Biến thể c.880C>T ở bệnh nhi số 1 thay đổi protein Arginine thành codon dừng phiênmã. Hình 3: Biến thể c.85A>T ở bệnh nhi số 2 thay đổi protein Lysine thành codon dừng phiênmã. 30 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Sức khỏe, 1(1):27-34 Hình 4: Biến thể vùng intron c.377+13A>C, c.377+22C>G ở bệnh nhi số 3. Hình 5: Biến thể vùng intron c.378-74C>T ở bệnh nhi số 4 của protein MECP2. Về mặt lâm sàng, hai bệnh nhi Rett mang hai biến thể này có những đặc điểm kiểu hình Rett điển hình, xét nghệm gen khi đã ở giai đoạn muộn khi bệnh nhân số 1 mười tuổi và bệnh nhân số 2 sáu tuổi. Hai bệnh nhân này mất ngôn ngữ và mất khả năng giao tiếp; mất khả năng điều khiển tay, không thực hiện được các hoạt động tay phối hợp. Có các cử động tay bất thường không chủ đích: đưa tay vào miệng, thực hiện thao tác xoắn vặn bàn tay ngón tay; khó khăn và không thể đi đứng bình thườngđược, hay té ngã do rối loạn trương cơ; bất thường kiểu thở với đặc điểm thở mạnh và chảy nhiều nước bọt; phát triển thể chất bất thường đặc biệt là gù lưng và một số biểu hiện không đặc hiệu khác như gầy ốm, hay la hét, dễ kích động Gần đây, nghiên cứu về biến thể genMECP2 trên hội chứng Rett ở nước ta chỉ còn rất hạn chế và chỉ mới tập trung vào các exon 2, 3 và 4 21. Do vậy, nghiên cứu này là bước đầu để phân tích thay đổi trên toàn bộ 4 exon của genMECP2 ở các bệnh nhânmắc hội chứng Rett; từ đó, thiết lập được quy trình xét nghiệm gen MECP2 nhanh, tiết kiệm và đáng tin cậy, góp phần phát hiện và tầm soát biến thể gen liên quan đến hội chứng Rett, giảm bớt gánh nặng cho các gia đình có bệnh nhân mắc bệnh. Nghiên cứu được thực hiện trên số mâũ khá hạn chế, do vậy đây chỉ là nghiên cứu khởi đầu cho bước tiếp theo thực hiện nghiên cứu trên số lượngmâũ lớn để ứng dụng triển khai trên lâm sàng. Tuy vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã bổ sung được 1 biến thể gây bệnh (c.85A>T) và 1 SNV (c.377+13A>C) mới vào ngân hàng dữ liệu biến thể genMECP2 thế giới. KẾT LUẬN Chúng tôi đã xây dựng thành công và hoàn thiện quy trình phát hiện đột biến điểm trên gen MECP2 bằng kỹ thuật PCR-sequencing trên các bệnh nhi mắc hội chứng Rett. Nghiên cứu này là cơ sở để triển khai khảo sát biến thể gen MECP2 trên bệnh nhân hội chứng Rett. Nghiên cứu này được tài trợ bởi Đại học Quốc gia TP.HCM (Mã số đề tài C2018-44-02). 31 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Sức khỏe, 1(1):27-34 DANHMỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MECP2: Methyl CpG binding Protein 2 PCR: Polymerase Chain Reaction ACMG: American College of Medical Genetics and Genomics SNV: Single Nucleotide Variant c.880C>T: Biến thể tại vị trí 880 trên vùngmã hoá gen làm thay đổi nucleotide C thành T so với gen tham chiếu c.85A>T: Biến thể tại vị trí 85 trên vùng mã hoá gen làm thay đổi nucleotide C thành T so với gen tham chiếu c.602C>T: Biến thể tại vị trí 602 trên vùngmã hoá gen làm thay đổi nucleotide C thành T so với gen tham chiếu c.377+13A>C: Biến thể tại vùng intron trên cách vùng mã hoá 13 nucleotide tại vị trí 377 làm thay đổi nucleotide A thành C so với gen tham chiếu c.377+22C>G: Biến thể tại vùng intron trên cách vùng mã hoá 22 nucleotide tại vị trí 377 làm thay đổi nucleotide A thành T so với gen tham chiếu c.378-74C>T: Biến thể tại vùng intron trên cách vùng mã hoá 74 nucleotide tại vị trí 378 làm thay đổi nu- cleotide A thành T so với gen tham chiếu p.R294X: Acid amin Arginine tại vị trí 294 bị thay đổi thành codon dừng phiên mã so với protein tham chiếu p.K29R: Acid amin Lysin tại vị trí 29 bị thay đổi thành codon dừng phiên mã so với protein tham chiếu XUNGĐỘT LỢI ÍCH Nhóm tác giả cam kết rằng không có xung đột lợi ích khi thực hiện nghiên cứu này. ĐÓNGGÓP CỦA TÁC GIẢ Tất cả tác giả đã đóng góp vào việc thiết kế nghiên cứu, giải thích kết quả nghiên cứu, viết và chỉnh sửa bản thảo của bài báo, xem xét cẩn thận đồng ý nộp bản thảo hoàn chỉnh này. ĐẠOĐỨC TRONGNGHIÊN CỨU Y SINH Nghiên cứu thuộc đề tài C2018-44-02 ĐHQG TPCHM của KHOA Y ĐHQG TPHCM đã được phê duyệt về các vấn đề đạo đức trong nghiên cứu y sinh học, chấp thuận số CS/N2/18/01HT của Hội đồng khoa học/Y đức Bệnh Viện Nhi Đồng II. PHỤ LỤC 1 Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh nhân mắc hội chứng Rett thu mẫu cho nghiên cứu này 2. Chỉ tiêu đánh giá Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân: Bệnh nhân được chẩn đoán mắc hội chứng Rett cả điển hình hoặc Rett không điển hình. A. Bệnh nhân được chẩn đoán mắc hội chứng Rett điển hình khi: (1) Bệnh nhân tồn tại một giai đoạn phục hồi (hồi quy) (2) Có tất cả các tiêu chuẩn chính (bảng bên dưới) và không bao gồm các tiêu chuẩn loại trừ (bảng bên dưới). (3) Có các tiêu chuẩn phụ trợ đi kèm, điều này là không bắt buộc tuy nhiên trẻ thường sẽ có hầu hết các đặc điểm trong tiêu chuẩn phụ trợ. B. Bệnh nhân được chẩn đoán mắc hội chứng Rett không điển hình khi: (1) Bệnh nhân tồn tại một giai đoạn phục hồi (hồi quy) (2) Ít nhất 2 trong số 4 tiêu chuẩn chính (3) 5 trên 11 tiêu chuẩn phụ trợ Ngoài ra tiêu chuẩn: giảm kích thước vòng đầu của trẻ chưa được xem xét trong bảng tiêu chuẩn này. Ở đây, chúng tôi tạm đánh giá tiêu chuẩn này là 1 tiêu chuẩn phụ trợ. TÀI LIỆU THAMKHẢO 1. Rett A. On a unusual brain atrophy syndrome in hyperam- monemia in childhood. Wiener Medizinische Wochenschrift. 1966;116(37):723–726. 2. Jeffrey LN, Walter EK, Daniel GG, John C, Angus JC, Alan KP, et al. RettSearch ’Rett Syndrome: Revised Diagnostic Crite- ria and Nomenclature’. Ann Neurol. 2010;68:944–950. PMID: 21154482. Available from: https://doi.org/10.1002/ana.22124. 3. Rett A. Rett Syndrome. History and General Overview. Am J Med Genet Suppl. 1986;1:21–25. PMID: 3087183. Available from: https://doi.org/10.1002/ajmg.1320250503. 4. Matthew JL, Adrian B, Rett Syndrome: A Complex Disorder with Simple Roots. Nat Rev Genet. 2015;16:261–275. PMID: 25732612. Available from: https://doi.org/10.1038/nrg3897. 5. Kankirawatana P, Leonard H, Ellaway C, Scurlock J, Percy AK, et al. Early Progressive Encephalopathy in Boys and MECP2 Mu- tations. Neurology. 2006;67:164–166. PMID: 16832102. Avail- able from: https://doi.org/10.1212/01.wnl.0000223318.28938. 45. 6. Amir RE, Veyver IB,WanM, Tran CQ, Francke U, Zoghbi HY. Rett Syndrome Is Caused byMutations in X-LinkedMECP2, Encod- ing Methyl-Cpg-Binding Protein 2. Nat Genet. 1999;23:185– 188. PMID: 10508514. Available from: https://doi.org/10.1038/ 13810. 7. Webb T, Latif F. Rett Syndrome and the MECP2 Gene. J Med Genet. 2001;31:217–223. PMID: 11283201. Available from: https://doi.org/10.1136/jmg.38.4.217. 8. Percy AK, Lane JB, et al. Rett Syndrome: Clinical and Molec- ular Update. Curr Opin Pediatr. 2004;16:670–677. PMID: 15548931. Available from: https://doi.org/10.1097/01.mop. 0000143693.59408.ce. 9. Percy AK, Lane JB, Childers J, Skinner S, Annese F, MacLeod P. Rett Syndrome: North American Database. J Child Neurol. 2007;22:1338–1341. PMID: 18174548. Available from: https: //doi.org/10.1177/0883073807308715. 10. Ariani F, HayekG, Rondinella D, Artuso R, Renieri A, et al. Foxg1 Is Responsible for the Congenital Variant of Rett Syndrome. Am J Hum Genet. 2008;83:89–93. PMID: 18571142. Available from: https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2008.05.015. 32 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Sức khỏe, 1(1):27-34 Bảng 2: Tiêu chuẩn chính 1 Mất một phần hoặc toàn bộ các kỹ năng tay có chủ đích. 2 Mất một phần hoặc toàn bộ kỹ năng ngôn ngữ. 3 Bất thường vận động đi đứng: khiếm khuyết hoặc không đi lại. 4 Cử động tay đơn giản: xoắn vặn bàn tay, vỗ tay, rửa tay hay cử động đưa tay vào miệng. Tiêu chuẩn phụ trợ 1 Thở khó khi thức 2 Nghiến răng khi thức 3 Rối loạn giấc ngủ 4 Đặc điểm cơ bất thường 5 Rối loạn nhịp mạch 6 Chứng cong vẹo cột sống/gù. 7 Chậm phát triển thể chất: giảm cân 8 Bàn tay nhỏ và lạnh 9 Rối loạn hành vi: Cười hoặc la hét 10 Giảm phản ứng với cơn đau 11 Trẻ biểu hiện tự kỷ: giảm giao tiếp bằng mắt Tiêu chuẩn loại trừ Rett điển hình/không điển hình 1 Chấn thương não do chấn thương sọ não (peri hoặc hậu sản), bệnh thần kinh, hoặc nhiễm trùng nặng gây ra các vấn đề thần kinh. 2 Sự phát triển thần kinh bất thường trước 6 tháng đầu đời. 11. Bahi-Buisson N, Nectoux J, Rosas-Vargas H, Milh M, Bienvenu T, et al. Key Clinical Features to Identify Girls with Cdkl5 Muta- tions. Brain. 2008;131:2647–2661. PMID: 18790821. Available from: https://doi.org/10.1093/brain/awn197. 12. Friez MJ, Jones JR, Clarkson K, Lubs H, Stevenson RE, et al. Recurrent Infections, Hypotonia, and Mental Retardation Caused by Duplication of MECP2 and Adjacent Region in Xq28. Pediatrics. 2006;118:e1687–e1695. PMID: 17088400. Available from: https://doi.org/10.1542/peds.2006-0395. 13. Nagarajan RB, Hogart AR, Gwye Y, Martin MR, LaSalle JM. Re- ducedMECP2 Expression Is Frequent in Autism Frontal Cortex and Correlates with Aberrant MECP2 Promoter Methylation. Epigenetics. 2006;1:e1–e11. PMID: 17486179. Available from: https://doi.org/10.4161/epi.1.4.3514. 14. Reichwald K, Thiesen J, Wiehe T, Weitzel A, Platzer M, et al. Comparative sequence analysis of the MECP2-locus in hu- man andmouse reveals new transcribed regions. Mammalian Genome. 2000;11:182–190. PMID: 10723722. Available from: https://doi.org/10.1007/s003350010035. 15. Aline Q, SalihaY, Hervé F, Thierry B, AnneM, Christophe P, et al. Deleterious mutations in exon 1 of MECP2 in Rett syndrome. European Journal of Medical Genetics. 2006;49(4):313–322. PMID: 16829352. Available from: https://doi.org/10.1016/j. ejmg.2005.11.002. 16. Carol JS, Berge EM, Eva WCC, Weiwei Z, John BV. Novel exon 1 mutations in MECP2 implicate isoform MeCP2_e1 in classi- cal Rett syndrome. Am J Med Genet. 2009;149A:1019–1023. PMID: 19365833. Available from: https://doi.org/10.1002/ajmg. a.32776. 17. Bartholdi D, Klein A, Weissert M, Koenig N, Mátyás G, et al. Clinical profiles of four patients with Rett syndrome carry- ing a novel exon 1 mutation or genomic rearrangement in the MECP2 gene. Clin Genet. 2006;69(4):319–326. PMID: 16630165. Available from: https://doi.org/10.1111/j.1399- 0004.2006.00604.x. 18. Krishnaraj R, Ho G, Christodoulou J. RettBASE: Rett syndrome database update. Hum Mutat [RettBASE: RettSyndromeorg Variation Databasemecp2chweduau] . 2017;PMID: 28544139. Available from: https://doi.org/10.1002/humu.23263. 19. Richards S, et al. Standards and guidelines for the interpre- tation of sequence variants: a joint consensus recommen- dation of the American College of Medical Genetics and Ge- nomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17(5):405–424. PMID: 25741868. Available from: https://doi.org/10.1038/gim.2015.30. 20. ;Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp. 21. Huong LTT, Trinh DTD, Chinh VD, Ha LTT, Hoa BTP, and Liem NT. Spectrum of MECP2 mutations in Vietnamese patients with RETT syndrome. BMC Med Genet. 2018;19:137. PMID: 30081849. Available from: https://doi.org/10.1186/s12881- 018-0658-x. 33 Science & Technology Development Journal – Health Sciences, 1(1):27-34 Open Access Full Text Article Research Article 1Children’s Hospital II HCM, Vietnam 2Ton Duc Thang University, Vietnam 3School of Medicine-VNU HCM, Vietnam 4Nong Lam University HCM, Vietnam History Received: 23-06-2020 Accepted: 22-9-2020 Published: 10-11-2020 DOI : Copyright © VNU-HCM Press. This is an open- access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International license. An optimizedmethod for detection of MECP2 point mutations in Vietnamese children with rett syndrome Le Thi Khanh Van1, Le Duy Thai Duong2, Do Thi Thu Hang3, Huynh Thi Thuy Kieu1, Nguyen Le Trung Hieu1, Bui Thi Thuy Dung4, Nguyen Thanh Vu3, Nguyen Quoc Dung3, Huynh Thi Dieu Hien3 Use your smartphone to scan this QR code and download this article ABSTRACT Background: Rett syndrome is a rare disease but affecting severe brain dysfunction. The rate of the syndrome is estimated to be 1/10,000–1/15,000 female births. This disorder is knowledge caused by de novo mutations in the MECP2 gene. More than 80% of patients with Rett syndrome have a point mutations in MECP2. The study correlation genotype-phenotype open to therapeutic opportunities for patients. In Vietnam, to validate the diagnosis, the doctors are mainly clinical diagnostic standards, not include genetics testing. Therefore, optimize the producer to determine MECP2 variations is necessary that provides evidence for clinical diagnosis, supporting the early- stage diagnosis of pediatric patients. Methods: Standardization of the MECP2 gene testing sequence used the healthy control blood samples includes PCR optimization and Sanger sequencing. Read raw sequence data by CLCwork- bench software. Analysis variations; evaluate the pathogenic of the variants with ACMG standard. After that, the process was applied to 4 pediatric patients with Rett syndrome treated at Children's Hospital II from 01/2019 to 12/2019. Result: We successfully optimized PCR-Sanger sequencing for the testing MECP2 variants gene, especially in exon 1 had high GC-percent (>65%). The quality sequencing result was quite reliable. We found two pathogenic mutations (p.R294X, p.K29X); and a novel mutation (p.K29X). Conclusion: The process of the test gene MECP2 by PCR technique-Sanger sequencing was opti- mized completely, and add a novel mutation to the MECP2 variation database. Key words: Rett syndrome, MECP2, Sanger sequencing Cite this article : Van L T K, Duong L D T, Hang D T T, Kieu H T T, Hieu N L T, Dung B T T, Vu N T, Dung N Q, Hien H T D. An optimized method for detection of MECP2 point mutations in Vietnamese children with rett syndrome. Sci. Tech. Dev. J. - Health Sci.; 1(1):27-34. 34
File đính kèm:
- xay_dung_quy_trinh_phat_hien_dot_bien_diem_tren_gen_mecp2_o.pdf